LABORATOR SPECTROMETRIE MASA

Analiza sistematică a expresiei (bio)moleculelor este efectuată prin implicarea metodelor ultramoderne sensibile şi de înaltă rezoluţie de detectare şi fragmentare a markerilor moleculari precum sistemele avansate de spectrometrie de masă cu ionizare chip electrospray în combinaţie cu metode de separare eficientă (HPLC)

Aplicatii in:

Aparatul este utilizat pentru determinarea  maselor moleculare ale biomoleculelor nevolatile cu mase cuprinse între câţiva zeci de daltoni şi câteva mii de daltoni. Performanţele deosebite constau în special în faptul că existǎ posibilitatea fragmentǎrii multiple MSn prin ciclul izolare-fragmentare, utilizând capcana ionică şi sursa CID sau ETD, dar şi realizarea fragmentărilor de mare sensibilitate a biomoleculelor cum sunt cele din grupa glicopeptidelor unde poate rupe legatura covalentă peptidică în timp ce legătura zaharidică, deşi mai slabă, rămâne intactă. Aceste două proprietăţi ale instrumentului ne permit să facem  identificarea dar şi determinarea structurii diferitelor tipuri de biomolecule cum ar fi proteoglicanii, glicosaminoglicanii, glicolipidele, glicosfingolipidele, etc. Printre celelalte performanţe enumerăm aici înalta sensibilitate (infuzie cu cantităti de probă de ordinul zecilor de nl/min) dar şi versatilitatea lui prin posibilitatea cuplajului cu diferite surse de infuzie. Sursele de infuzie a probelor, produse de Bruker Daltonics, sunt: on-line microelectrospray, off-line nanoelectrospray, on-line nanoelectrospray. In cadrul laboratorului s-a realizat cuplajul unui robot automat de infuzie prin chip electrospray cu spectrometrul de masa printr-un sistem de interfatare realizat în cadrul institutului. Robotul infuzeaza probele (10 secunde/proba) printr-un chip de siliciu cu 400 de orificii, debitul fiind, in medie, de 50-200 nl/min. Combinaţia dintre sistemul robotizat chipESI şi spectrometrul de masă permite automatizarea infuziei/manipulării probelor la sensibilitate foarte ridicată, cu consum minim de proba şi viteză mare de analiză (50 enşantioane/oră). Ca avantaje ale acestui cuplaj menţionǎm: functionarea in regim HTS (high throughput screening); capacitate probe la o singura incarcare: 96; viteza infuzie; sensibilitate attomolar (proteomica), picomolar (glicomica).

Caracteristicile probelor analizate:

Probele care pot fi analizate prin spectrometrie de masǎ pot fi de naturǎ organica sau anorganica, sistemul este aplicabil amestecurilor complexe nevolatile cum sunt de regulă toate extractele naturale şi permite identificare „de novo” a componenţilor prezenţi chiar la nivel de urmă. Printre biomoleculele analizate de noi menţionǎm: glicosfingolipide sialilate, glicosaminoglicani, proteoglicani etc. Probele analizate prin spectrometrul de masa HCT ultra trebuie diluate in solvenţi volatili pentru a permite ionizarea la presiunea atmosfericǎ.

Spectrul ((-) chip nanoESI HCT MS) unor fructooligozaharide sintetizate din sucrozǎ şi rafinozǎ de catre proteina Lsc3, cu ajutorul integrǎrii genei responsabile de producerea ei în genomul bacteriei E. coli. Toti ionii sunt simplu încǎrcaţi. Gal corespunde galactozei, G glucozei şi F fructozei. ♦ = [FnGGal-H+]-; ● = [FnGGal-H++H2O]-; ■ = [FnGGal+HCOO-]-; ▲= [FnGGal+ PO43-+2H+]-; * = [FnGGal+PO43-+2H++H2O]-; ○ = [FnGGal-H-+2H2O]-. Notaţia MS2 este folositǎ pentru a marca ionii care vor fi fragmentaţi prin CID.

Spectrul (-) nanoESI chip HCT MS1 al amestecului nativ de gangliozide extrase din tesut de fetus anencefalic.

În figura de mai sus este ilustrat un spectru de fragmentare al ionului 1063.34, care este corespunzǎtor unei gangliozide (glicosfingolipidǎ), GT1 (d18:1/18:0), existentǎ în rǎmǎşiţele creierului unui fetus anencefalic (malformaţie congenitalǎ) aflat in saptǎmâna a 28-a de gestaţie.

Pentru analiza MS, soluţia stoc se prepară prin dizolvarea materialului uscat în metanol şi apoi stocat la -27˚C. Diluţia soluţiei stoc cu metanol pur se efectueazǎ in scopul obţinerii  probelor uscate la concentraţii brute estimate de aproximativ 5 pmol/µL (calculata pentru o masa moleculara medie de 2000 g/mol) pentru experimentele cu cu nanoESI HCT MS cu chip. Metanolul a fost obţinut de la Merck (Darmstadt, Germania) şi folosit fără purificare ulterioară. In vederea eliminarii posibilitatii de blocare a orificiilor extrem de inguste ale microchipurilor de siliciu, toate solutiile se centrifugheazǎ 2 h utilizand o centrifuga de tip SIGMA 2-16 Sartorius, GmbH (Göttingen,Germania) la 5000 r.p.s. Probele cu continut ridicat de saruri se desalifiazǎ prin dializa (4 zile) in 5 mM acetat de amoniu la 40C utilizand membrane de 500 Da „cut-off” de la Schuell, Darmstadt, Germania. Solutiile sunt liofilizate într-un evaporator rapid cu vid SpeedVac Concentrator, SPD 111V-230 de la Thermo Electron Corporation, (Asheville, NC, USA), cuplat cu o pompa de vid PC 2002 Vario cu controler CVC 2000 de la Vaccubrand (Wertheim, Germania).
Platforma nanoelectrospray  bazata pe chip cu infuzie automata  a fost realizata pe o tehnologie NanoMateTM400 incorporând chip-ul ESI (Advion BioSciences, Ithaca, USA) montate pe spectrometrul de masă HCT MS. Robotul e controlat şi manipulat printr-un software ChipSoft 7.1.1 sub sistemul de operare Windows. Poziţia chip-ului pentru electrospray a fost ajustata fata de contraelectrodul conic de transfer al probei. In scopul îmbunătăţirii transferului  optim al speciilor ionice în spectrometrul de masă sistemul NanoMate se poziţioneazǎ la o distanta cât mai micǎ (ex. 5 mm) de contraelectrodul spectrometrului de masa. 10µL eşantion  din soluţiile probelor de lucru se încărcǎ pe o placa de microtitrare având 96 de minirecipiente. Robotul se programeazǎ să aspire volumul dorit de probă (în parametrii situaţi între 5-200 µL) urmată de 2µL de aer în vârful pipetei şi apoi plasarea probei pe faţa cu orificiu a microchip-ului. Electrospray-ul se iniţiazǎ  aplicând o tensiune  de 0.8 kV pe vârful pipetei şi o presiune asupra tubului de infuzie  de 0.6 p.s.i.  După infuzia probei şi analiza MS vârful pipetei se ejecteazǎ automat  şi un vârf nou îl înlocuieşte pentru fiecare probă, prevenind astfel orice contaminare. Tot in scopul prevenirii contaminarii, fiecare proba se depune intr-o duza noua si nefolosita a placii. Intre experimente placa cu cele 96 de duze se acoperǎ cu un strat de parafilm pentru a impiedica evaporarea solutiei metanolice

Laboratorul de spectrometrie de masǎ oferă serviciul de analiză structurală completă pentru diverse compoziţii de natură biologică cu identificare de compuşi necunoscuţi şi/sau biomarkeri prezenţi în cantitǎţi infime.

Sef laborator:

Str. Plautius Andronescu Nr.1